NEBNext®Q5熱啟動(dòng)高保真PCR Master Mix是Q5高保真DNA聚合酶的原始熱啟動(dòng)NEBNext配方。該制劑也作為成分包含在所有用于DNA和RNA文庫制備的原始NEBNext Ultra試劑盒中。

預(yù)混液中均有 Q5 超保真 DNA 聚合酶，它是一種具備熱穩(wěn)定性的新型 DNA 聚合酶，具有 3′→5′ 核酸外切酶活性，并且融合了具有增強(qiáng)持續(xù)合成能力的 Sso7d 結(jié)構(gòu)域。Q5 還具有優(yōu)異的保真度（比 Taq DNA 聚合酶高 280 倍），錯(cuò)配率極低。

這款便捷的 2X 預(yù)混液包含 dNTP、Mg++ 以及專有緩沖液，僅需加入引物和 DNA 模板，即可穩(wěn)健擴(kuò)增。加入熱啟動(dòng)適配體后，可以更方便地在室溫下建立反應(yīng)體系。

操作使用：

1. 使用高質(zhì)量、純化的DNA模板可大大提高PCR反應(yīng)的成功率。50μl反應(yīng)的DNA模板推薦量如下：

2. Mg++和添加劑：

NEBNext Q5 熱啟動(dòng) HiFi PCR 預(yù)混液在 1X 濃度下使用時(shí)含有 2.0 mM Mg ++。這對于使用該預(yù)混液產(chǎn)生的大多數(shù)PCR產(chǎn)物是最jia選擇。

3. 脫氧核苷酸：

dNTP的最終濃度經(jīng)過優(yōu)化，可實(shí)現(xiàn)穩(wěn)健的文庫擴(kuò)增。Q5 高保真 DNA 聚合酶不能摻入 dUTP，不建議與含有尿嘧啶的引物或模板一起使用。

4. DNA聚合酶濃度：

NEBNext Q5 熱啟動(dòng) HiFi PCR 預(yù)混液中 DNA 聚合酶的濃度經(jīng)過優(yōu)化，可在各種條件下獲得最佳結(jié)果。

5. 變性：

對于大多數(shù)樣品類型，在 98°C 下 30 秒的初始變性就足夠了。在熱循環(huán)過程中，變性步驟應(yīng)保持在zui低限度。通常，對于大多數(shù)模板，建議在 98°C 下變性 10 秒。

6. 退火：

對于 NEBNext 索引引物以外的 NGS 引物，Tm 可能不同。在這種情況下，在 Tm 下使用 30 秒（使用 NEB Tm 計(jì)算器），在 65°C 下使用 45 秒。

7. 外延：

推薦的延伸溫度為 65°C。 對于最大 1 kb 的庫，擴(kuò)展時(shí)間通常為 30 秒。較大的刀片長度可能需要額外的時(shí)間。建議在 65°C 下最后一次延長 5 分鐘。

8. PCR產(chǎn)物：

使用 NEBNext Q5 熱啟動(dòng) HiFi PCR 預(yù)混液生成的 PCR 產(chǎn)物具有鈍端。

9. 磁珠兼容性：

NEBNext Q5 熱啟動(dòng) HiFi PCR 預(yù)混液與多種羧基化、甲苯磺?；玩溍褂H和素微珠兼容，這些微珠可繼承或包含在文庫構(gòu)建方案的 PCR 步驟中，包括 Agencourt AMPure XP （Beckman Coulter， Inc.）、Sera-Mag SpeedBeads 和 Mag-Bind RXNPure Plus （Omega Bio-tek， Inc.）。建議使用SPRI微球或PCR純化柱進(jìn)行PCR后純化。®®®

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